Forschung

Antikörper können durch Proteolyse oder Gentechnik in kleinere antigenbindende Fragmente zerlegt werden, um mono- oder multivalente Fragmente zu erzeugen. Diese basieren hauptsächlich entweder auf Fab-Fragmenten oder dem single-chain Fv (scFv) als Bausteine. Der Fv-Teil eines IgGs, bestehend aus der VH- und VL-Domäne, ist das kleinste Fragment, das die volle Bindungskapazität des intakten Antikörpers aufweist.

Wir haben einen Werkzeugkasten von Methoden zur Übertragung der genetischen Informationen für Antikörper von tierischen B-Zellen auf Hefe entwickelt. Tiere werden mit einem Zielprotein von Interesse immunisiert und die mRNA wird aus B-Zellen extrahiert, in DNA umgewandelt, amplifiziert und in einen Hefehintergrund übertragen. Das Ergebnis ist ein Satz von Hefezellen, die jeweils eine Antikörpervariante in mehreren Kopien auf der Zelloberfläche präsentieren. Für die Identifizierung von Antikörpern mit den gewünschten Bindungseigenschaften wird die Hochdurchsatz fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (fluorescence-activated cell sorting, FACS) verwendet.

Die derzeitigen Immuntherapien beruhen auf der Bekämpfung von Tumormarkern, die auf den Lymphomzellen überexprimiert, aber auch auf gesunden Zellen vorhanden sind. Folglich führen Standardbehandlungen oft zu schweren Nebenwirkungen. Daher könnte eine Präzisionsmedizin, die auf einer personalisierten Therapie basiert, für die Lymphombehandlung von Vorteil sein. Bei B-Zell-Lymphomen exprimieren die Krebszellen einen tumorspezifischen und funktionell aktiven B-Zell-Rezeptor (BCR), auch Idiotyp (Id) genannt, der sich von der homologen Struktur gesunder Zellen unterscheidet. Im Gegensatz zu herkömmlichen Antikörpern von Säugetieren haben Knorpelfische eine einzigartige Form von nur schweren Kettenantikörpern, die als Immunglobulin-Neuantigen-Rezeptor (IgNAR) bezeichnet werden, mit einer variablen Domäne (vNAR), die für die Antigenbindung verantwortlich ist. Aus hefegestützten, halbsynthetischen vNAR-Bibliotheken wurden Binder identifiziert, die spezifisch auf die BCR verschiedener Lymphom-B-Zelllinien ausgerichtet sind. In der laufenden Arbeit konzentrieren wir uns auf das Design verschiedener anti-idiotypischer vNAR-Formate für die Entwicklung einer personalisierten Lymphom-Behandlung auf kosten- und zeiteffiziente Weise bei gleichzeitiger drastischer Reduzierung der Nebenwirkungen.

Neben Antikörpern mit der klassischen Zusammensetzung aus schwerer und leichter Kette umfasst das adaptive Immunrepertoire von Haien auch einen Schwere-Ketten-Isotyp, bei dem die Antigenbindung ausschließlich durch eine kleine und hochstabile Domäne, die als vNAR bezeichnet wird, vermittelt wird. In den letzten Jahren haben sich vNAR-Fragmente aufgrund ihrer hohen Affinität und Spezifität in Verbindung mit ihrer geringen Größe, ihrer hohen physikochemischen Stabilität und ihrer kostengünstigen Produktion zu vielversprechenden target-bindenden Gerüstmolekülen entwickelt, die für medizinische und biotechnologische Anwendungen maßgeschneidert werden können.

Hochaffine, von Haien abgeleitete Nanobodies (vNARs) wurden für eine Vielzahl von verschiedenen Antigenen identifiziert. Durch die Verwendung halbsynthetischer Bibliotheken konnten wir spezielle Merkmale wie pH-abhängige Bindung implementieren. vNARs sind besonders nützlich für die Erzeugung von anti-idiotypischen Bindern die gegen therapeutische Antikörper gerichtet sind. Wir haben eine neue Methode entwickelt, um das therapeutische Fenster von Krebsantikörpern zu erweitern, indem wir ihre Antigen-Bindungsstelle mit einem anti-idiotypischen vNAR maskieren. Das ultimative Ziel ist die Erzeugung eines vNAR-Antikörper-Fusionsproteins, das den Antikörper im normalen Gewebe inaktiviert, während er in der Mikroumgebung des Tumors aktiviert wird.

Vor kurzem wurden Antikörper aus Hühnern aufgrund ihrer breiten Epitopabdeckung und der einfachen Bibliothekserstellung zu interessanten therapeutischen und diagnostischen Einheiten. Das Ziel unserer Forschung ist die Entwicklung von Antikörper der nächsten Generation, wie bispezifische und biparatopische mAbs. Um die korrekte Kettenpaarung zu erleichtern, werden die Knob-into-hole-Technologie sowie common light chains (cLC) verwendet. Das Mischen der leichten Ketten zur Verbesserung der Affinität und bibliotheksbasierte Humanisierungsansätze werden eingesetzt, um Antikörperkandidaten mit maßgeschneiderten Eigenschaften zu erzeugen. Darüber hinaus werden bibliotheksbasierte Methoden zur Erzeugung pH-sensitiver bispezifischer Antikörper erforscht, die neue Wirkungsweisen ermöglichen können. Die Etablierung einer neuartigen, FACS-unterstützten Screening-Methode auf der Basis von Hefe-Biopanning erweiterte das Repertoire an Screening-Technologien für cLC-basierte Antikörper.

Sactipeptide gehören zu der Klasse der ribosomal synthetisierten und posttranslational modifizierten Peptide (RiPPs) bakteriellen Ursprungs. Diese einzigartigen Peptide enthalten mindestens eine Thioetherbrücke, die eine Verbindung zwischen dem Thiol eines Cysteinrests und dem α-Kohlenstoff einer Partneraminosäure darstellt. Diese einzigartige Verknüpfung verleiht diesen Peptiden eine außergewöhnliche chemische Stabilität und Konformationsstarrheit. Die Stabilität und die antimikrobielle Aktivität von Sactipeptiden (auch als Sactibiotika bekannt) macht sie zu hochinteressanten Forschungszielen. Da bisher nur wenige dieser Peptide identifiziert werden konnten, konzentriert sich unsere Forschung auf die Identifizierung und strukturelle und funktionelle Charakterisierung neuartiger Sactipeptide. Daher werden verschiedene vorhergesagte Sactipeptid-Gencluster, die durch Genom-Mining gefunden wurden, auf das Vorhandensein der sauerstoffsensitiven, radikalischen SAM-Enzyme und Sactipeptide analysiert.

Nähere Informationen finden sich in unserer Publikation in Angewandte Chemie

Darüber hinaus arbeiten wir an der Etablierung einer Hochdurchsatz-Plattform für das Screening von Sactipeptidvarianten mit neuartigen Funktionalitäten. Kürzlich haben Urban et al. 2017 und Hetrick et al. 2018 eine Lanthipeptid-Screening-Plattform mit Phagendisplay bzw. Hefedisplay entwickelt Ein Hochdurchsatz-Screening von Sactipeptiden muss jedoch noch erarbeitet werden.

Studien über Protein-Protein-Interaktionen ermöglichen ein besseres Verständnis der Prozesse, die in ganzen Zellen ablaufen. Der BioID-Screen (proximalitätsabhängige Biotin-Identifikation) ist ein nützliches Werkzeug, um diesen Zweck zu erreichen. Die Verschmelzung einer promiskuitiven Biotin-Ligase mit einem Protein von Interesse (POI) führt zur Biotinylierung aller mit ihr interagierenden Proteine. Das eingeführte Biotin ermöglicht eine einfache Reinigung und Identifizierung der Interaktionspartner. Die bisher verwendeten Biotin-Ligasen haben entweder ein großes Molekulargewicht oder eine langsame Reaktionsgeschwindigkeit. Um dieses Problem zu lösen, haben wir eine gezielte Evolution einer kleinen Biotin-Ligase aus A. aeolicus durchgeführt, um die katalytischen Eigenschaften zu verbessern. Nach der Generierung einer Error-Prone PCR-basierten Hefe-Oberflächen-Display-Bibliothek identifizierten wir zwei Mutanten, die einen höheren Umsatz als jede andere bekannte Ligase aufweisen.

Details finden sich in unserer Publikation.

Wir suchen nach Methoden zur Erhaltung der nativen Schwere-/Leichtketten-Paarung von B-Zellen während der Erzeugung von Hefe-Oberflächen-Display (YSD)-Bibliotheken. Zu diesem Zweck werden einzelne B-Zellen mit Poly(dT)-Magnetpartikeln in Lysepuffer unter Verwendung von Wasser-in-Öl-Emulsionsmikrofluidik eingekapselt. Nach der Zelllyse werden die Beads, die mRNA von Einzelzellen tragen, isoliert und in Reverse-Transkriptions-PCR (RT-PCR)-Puffer resuspendiert und für die PCR reemulgiert. Amplikons für VH- und VL-Domänen werden entweder über SOE-PCR oder Ligasekettenreaktion (LCR) kovalent verbunden. Die endgültigen PCR-Produkte können dann über die Golden Gate Assembly zu bidirektionalen Promotorvektoren für die YSD von Fab-Fragmenten zusammengesetzt werden.

Bislang ist das Repertoire an induzierbaren Transkriptionsaktivatoren in eukaryotischen Zellen begrenzt, und darüber hinaus weisen sie einige Nachteile auf. Während Tet-Off/On-basierte Systeme streng reguliert werden können, benötigen sie immer noch klinisch relevante Antibiotika. Für die Oberflächendarstellung von Proteinen auf Hefezellen (YSD) wird durch Induktion über Galaktose eine starke Transkriptionsaktivierung erreicht, die jedoch das Zellwachstum aufgrund der erforderlichen Abwesenheit von Glukose einschränkt. Die Erforschung von Stoffwechselwegen und von dem Aufbau komplexer genetischer Schaltkreise würde von der Entwicklung von neuen Transkriptionsregulatoren profitieren, die mit weniger anspruchsvollen Induktoren individuell schaltbar und in gewünschter Anzahl pro Zelle einsetzbar sind. Das 2017 veröffentlichte „Arbitrium“-System von Bakteriophagen könnte solche Proteine liefern.

Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs) sind eine neue Klasse von Molekülen für die gezielte Behandlung von Krebs. Sie kombinieren die bemerkenswerte Spezifität der therapeutischen Antikörper mit der hohen Wirksamkeit niedermolekularer Medikamente durch kovalente Verknüpfung beider Moleküle, um die starken Nebenwirkung der konventionellen Chemotherapie zu überwinden. Die derzeitigen Methoden zur Kopplung des zytotoxischen Sprengkörpers an den tumorangepassten Antikörper weisen jedoch eine Off-Target-Konjugation und eine geringe Spezifität auf. In dieser Forschung wird eine enzymatische Strategie mit mikrobieller Transglutaminase aus Streptomyces mobaraensis angewandt, die in der Lage ist, hochstabile Isopeptidbindungen zwischen den Seitenketten von Glutamin- und Lysinresten zu bilden, um diese Einschränkungen zu umgehen.

Die Ausstattung von Antikörpern, Nanokörpern oder anderen Molekülen, die bei der gezielten Therapie eingesetzt werden, mit dem hydrophilen Polysaccharid Dextran ermöglicht eine höhere Beladung der Zielmoleküle mit den Ladungen von Interesse (Schneider et al., 2019). Orthogonale Kupplungssysteme, insbesondere Clickreaktionen, ermöglichen die ortsspezifische Einführung von gewünschten Wirkstoffen an das Dextran-Gerüst. Die anschließende Anheftung von Dextran an den Targeting-Anti- oder Nanokörper kann entweder durch Biokonjugation unter Verwendung von Enzymen wie mikrobielle Transglutaminase (mTG), Sorte A (Sort A) oder durch Click-Chemie erfolgen.

Diese Konjugate zeichnen sich durch eine hohe Wirkstoff-Nutzlast aus, und bewahren oder verstärken dabei die Hydrophilie des Immunglobulins zur Erhaltung der Pharmakokinetik. Daher ist die Dextran-Funktionalisierung bereits zugelassener Zielmoleküle eine vielversprechende Strategie zur Entwicklung neuartiger und hocheffizienter Anti-Krebs-Wirkstoffe.

Die Immobilisierung von Sensormolekülen, z.B. Enzymen oder Antikörpern, auf der Oberfläche von Lignocellulosefasern ist entscheidend für jede papierbasierte bioanalytische Anwendung. Bis heute ist es nicht trivial, Biomoleküle durch gängige chemische Konjugationsstrategien gezielt, orthogonal und mit hoher Ladungsdichte auf der Oberfläche von Papierfasern zu immobilisieren.

Wir untersuchen eine allgemeine Methode für eine solche gerichtete Konjugation von Biomakromolekülen an Papierfasern, die auf einer chemischen Vorfunktionalisierung der Fasern mit thermisch stabilen Peptiden als selektive Linker-Moleküle basiert. Nach der Papierherstellung wird die ortsspezifische Immobilisierung der bioaktiven Proteine durch eine milde enzymkatalysierte Biokonjugation durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Arbeit werden zukünftige Forschungen zum detaillierten Verständnis von mikrofluidischen Papieren mit maßgeschneiderten biokatalytischen Eigenschaften ermöglichen.

Das therapeutische Potenzial von Biomakromolekülen (z.B. Proteine, Nukleinsäuren) ist aufgrund ihrer Unfähigkeit, intrazelluläre Ziele zu erreichen, begrenzt. Daher werden zunehmend Anstrengungen unternommen, molekulare Transporter wie z.B. zellpenetrierende Peptide (cell-pentrating peptides, CPPs) oder Liposomen zu entwickeln, um dieses Handicap zu überwinden. Trotz des raschen Fortschritts auf diesem Gebiet haben viele Transporter immer noch Defizite wie endosomaler Einschluss und Zytotoxizität. Wir konzentrieren uns auf den Transport von Peptid-Nukleinsäuren (PNA), einem synthetischen DNA-Analogon, und Proteinen vor allem in eukaryotische Zellen, durch die Verwendung von CPPs. Zusätzlich untersuchen wir, ob die mehrfache kovalente Bindung von CPPs an das Polysaccharid-Dextran-Gerüst zu einer höheren Wirksamkeit führt.

Die Sulfotools GmbH, ein Spin-off der TU Darmstadt, hat eine nachhaltige und kostengünstige Technologie für die Herstellung von Peptiden entwickelt. Die Clean Peptide Technology (CPT) basiert auf neuen, wasserlöslichen Schutzgruppen, deren Einsatz in der Peptidsynthese den Ersatz der bisher benötigten giftigen organischen Lösungsmittel durch Wasser ermöglichen.