Assayentwicklung

Um in Festphasenbibliotheken synthetischer Peptide und Peptidanaloga Bindungspartner für Chemokine zu finden, werden Durchmusterungsverfahren basierend auf Hochdurchsatzmikroskopie und Magnetseparation entwickelt. Markierungsfreie Assays werden etabliert, um in Sammlungen aus Naturstoffen Moleküle zu identifizieren, die an Chemokine binden. Ein wichtiges Verfahren zur Überprüfung der Bindungseigenschaften ist die Fluoreszenzpolarisation. Momentan etablieren wir einen Bindungsassay basierend auf Oberflächenplasmonresonan, mit dem die Bindung kleiner, unmarkierter Moleküle an immobilisierte Chemokine ermöglichen soll. An Immunzelllinien und primären Blutzellen wird schließlich die biologische Wirksamkeit solcher chemokinbindender Moleküle überprüft.

Fluoreszenzenzpolarisation

Werden Fluorophore mit polarisiertem Licht angeregt, so strahelen sie auch polarisiertes Licht ab. Die Polarisation ist dabei an Maß für die Begeglichkeit des Fluorophors. Auf diese Weise kann der Anteil freier, also beweglicher, fluoreszenzmarkierter Liganden und der Anteil proteingebundener, weniger beweglicher Liganden im Gleichgewicht bestimmt werden, ohne dass die beiden Spezies getrennt werden müssten. Auf diese Weise lassen sich Bindungskurven vermessen und Dissoziationskonstanten bestimmen. Abbildung 1 zeigt die Bindung eines fluoreszenzmarkierten Rezeptorpeptids aus CXCR1 an das Chemokin Interleukin-8. Da die beiden Bindungspartner zahlreiche, bei neutralem pH geladene Seitenketten ausweisen, ist die Bindung stark vom Salzgehalt der Lösung abhängig.

Abbildung 1: Bindungsisotherme für ein fluoreszenzmarkiertes Rezeptorpeptid an Interleukin-8 bei zwei verschiedenen Salzkonzentrationen. Aufgetragen ist die Anisotropie des emittierten Lichts bei 535 nm (© by K. Schmitz).
Abbildung 1: Bindungsisotherme für ein fluoreszenzmarkiertes Rezeptorpeptid an Interleukin-8 bei zwei verschiedenen Salzkonzentrationen. Aufgetragen ist die Anisotropie des emittierten Lichts bei 535 nm (© by K. Schmitz).

Chemotaxisassays

Abbildung 3: Boyden-Kammer für einen Transwellassay. Die Chemokine (grün) diffundieren in die obere Kammer und regen die Leukozyten zur Migration durch die Membran an (© by K. Schmitz).
Abbildung 3: Boyden-Kammer für einen Transwellassay. Die Chemokine (grün) diffundieren in die obere Kammer und regen die Leukozyten zur Migration durch die Membran an (© by K. Schmitz).

Die Migration in Richtung steigender Chemokinkonzentration (Chemotaxis) ist eine wichtige Reaktion von Leukozyten auf Chemokine. Im sogenannten Transwell-Assay werden isolierte humane Neutrophile in ein Gefäß gegeben, dass über einen Polycarbonatfilter mit einer darunterliegenden Kammer verbunden ist, in der sich eine Chemokinlösung befindet. Das Chemokin kann in die obere Kammer diffundieren und löst die Wanderung der Zellen durch die Poren der Membran aus. Die Anzahl der Zellen, die nach einer gegebenen Zeit in die untere Kammer gelangt sind, ist ein Maß für die Aktivität des Chemokins oder dafür, wie ein hinzugegebener Inhibitor diese Aktivität verringert.